Análise estrutural e princípios arquitetônicos dos cachos amilóides bacterianos

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Análise estrutural e princípios arquitetônicos dos cachos amilóides bacterianos

Volume de comunicações da natureza

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 2822 (2023) Citar este artigo

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Duas décadas se passaram desde a proposição inicial de que os amilóides não são apenas subprodutos (tóxicos) de uma cascata de agregação não intencional, mas também podem ser produzidos por um organismo para servir a uma função biológica definida. Essa ideia revolucionária nasceu da percepção de que uma grande fração da matriz extracelular que mantém as células Gram-negativas em um biofilme persistente é composta de fibras de proteína (curli; tafi) com arquitetura cross-β, cinética de polimerização dependente de nucleação e clássica propriedades tintoriais amiloides. A lista de proteínas que demonstraram formar as chamadas fibras amilóides funcionais in vivo se expandiu muito ao longo dos anos, mas informações estruturais detalhadas não seguiram em um ritmo semelhante, em parte devido às barreiras experimentais associadas. Aqui combinamos extensa modelagem AlphaFold2 e microscopia de transmissão crioeletrônica para propor um modelo atômico de protofibrilas curli e seus modos superiores de organização. Nós descobrimos uma diversidade estrutural inesperada de blocos de construção curli e arquiteturas fibril. Nossos resultados permitem uma racionalização da extrema robustez físico-química do curli, bem como observações anteriores da promiscuidade do curli entre espécies, e devem facilitar esforços adicionais de engenharia para expandir o repertório de materiais funcionais baseados no curli.

Embora uma vez considerado um alvo implausível para a biologia estrutural, desenvolvimentos recentes em microscopia crioeletrônica (cryoEM) e processamento helicoidal facilitaram a determinação da estrutura de fibrilas amiloides em resolução quase atômica1. Uma infinidade de estruturas determinadas experimentalmente de amilóides gerados in vitro e isolados ex vivo revelou uma diversidade estrutural desconcertante de arquiteturas de fibra, incluindo o conceito de polimorfos de fibra ou cepas de sequências de outra forma idênticas ou intimamente relacionadas2,3,4,5. Apesar das diferenças na arquitetura da protofibrila e na simetria helicoidal da fibra, a maioria das estruturas amilóides compartilha várias características conservadas que nos permitem expandir a definição da dobra amilóide além do tradicional adágio beta cruzado. Até onde sabemos, todas as estruturas amilóides atualmente descritas consistem em um empilhamento repetitivo de arranjos intrincados, serpentinos e planares de cadeia β que são estabilizados por motivos de zíper estéricos em que as cadeias laterais de resíduos interdigitadas formam extensas cadeias de Van der Waals, eletrostáticas, hidrofóbicas e de hidrogênio contatos de ligação. O empilhamento axial de peptídeos planares por ancoragem fita-fita e formação de β-arcada conduzem à formação de protofibrilas, geralmente seguida pelo enrolamento helicoidal de múltiplas protofibrilas em uma superestrutura helicoidal notavelmente estável. É precisamente essa simetria helicoidal que foi aproveitada com grande sucesso nas abordagens crioEM modernas para resolver os detalhes estruturais de uma ampla gama de estruturas amiloides.

A maioria dessas estruturas pertence a uma subfamília de espécies amilóides que estão correlacionadas a uma série de doenças (neuro) degenerativas, deposição sistêmica e mal dobradas. Por essa razão, essas proteínas amiloidogênicas são coloquialmente referidas como amiloides patológicos (PAs). Esses amilóides associados a doenças têm em comum o fato de representarem um evento de agregação e dobramento incorreto não funcional e fora do caminho de proteínas ou fragmentos de proteínas desestabilizados de atingir sua estrutura nativa por mutação, condições ambientais ou processamento incorreto. Existe um segundo ramo da família amilóide, encontrado em todos os domínios da vida, que consiste em proteínas que evoluíram para cumprir funções biológicas específicas (como adesão, armazenamento, andaimes, etc.) adotando o estado amilóide - proporcionando a essas proteínas o termo amiloides funcionais (FAs)6,7,8. Como amilóides patológicos, FAs mostram agregação dependente de nucleação em fibras com características β cruzadas. Uma questão enigmática é se as vias FA incluem características selecionadas para mitigar ou não o ganho citotóxico de propriedades funcionais tão comumente associadas a deposições patológicas de amilóide. Para vias amilóides bacterianas como curli e Fap, é claro que as proteínas acessórias garantem uma deposição amilóide oportuna e localizada, incluindo salvaguardas semelhantes a chaperonas que impedem ou interrompem a amiloidogênese prematura9,10. No entanto, se as estruturas das subunidades e fibras FA também incluem características adaptativas que reduzem a citotoxicidade, é muito menos compreendido. Curiosamente, há indicações de experimentos in vitro de que FAs produzidos por várias bactérias patogênicas podem exibir reatividade cruzada com PAs11, e relatos de uma indução potencialmente infecciosa ou agravamento de depósitos amilóides patológicos por cruzamento direto ou efeitos indiretos (inflamatórios) em humanos e animais expostos a amiloides bacterianos12,13. Como existem apenas algumas estruturas disponíveis para FAs14,15, não está claro neste momento se os FAs estão estruturalmente relacionados aos PAs e se formam um ramo separado das arquiteturas amiloides. Também não está claro qual poderia ser o mecanismo molecular para essa promiscuidade amiloide entre espécies FA/PA.

90 as high accuracy predictions, between 70 and 90 as good backbone predictions, and pLDDT <70 as low confidence and to be treated with caution31. All models share a similar β-solenoid architecture, wherein curlin repeats fold into strand-β-arc-strand motifs that stack vertically to produce an in-register double, parallel β-sheet structure with a single strand stagger (i.e., 2.4 Å) between both sheets (Fig. 2, Supplementary Fig. 2). This topology fits with our cryoEM observations on mature curlin fibrils, which we discuss in detail below. It also means that variations in the number of repeats correlate linearly to the long-axis dimension of a CsgA monomer, and that the curliome spans a continuum of solenoidal monomers./p>10 independent sample preparations./p>5 independent sample preparations./p>6 and higher; Table S2, Supplementary Fig. 15)45. Known structures including β-solenoid domains include, amongst others, antifreeze and ice binding proteins, phage tail spikes, adhesins, Leu-rich repeat proteins, glycosidases, S-layer proteins (Table S2; Supplementary Fig. 15,a). Our search did not identify any polymerizing or amyloid-like proteins. Instead, the β-solenoid domains form a structural scaffold for the protein monomers, rather than a polymerization unit. In these β-solenoid proteins, structural imperfections in the terminal solenoid motif(s) or additions of sterically blocking domains prevents polymerization by head-to-tail or tail-tail/head–head interactions of the monomers. Notably, a structural similarity against the human Alphafold protein structure database identifies several proteins showing open-edged β-solenoid domains (Supplementary Table 2; Supplementary Fig. 15b), including extracellular matrix proteins such as mucins and keratin associated proteins, or suprabasin and uncharacterized protein FLJ40521. It is unclear, however, whether these β-solenoid domains support polymerization in these proteins. In curli, the structural preservation and complementarity throughout the β-solenoid is guaranteed by a high degree of conservation of a limited number of key residues that partake in steric zipper contacts and the stabilization of β-arcade structures. In that respect, we note that Zhou and coworkers have shown that promiscuous cross-seeding can occur between curli produced in interspecies biofilms—a process that is likely dependent on a conserved curli architecture36. Also, extracellular matrix components such as curli have been proposed as a secreted public good, at least in single species biofilms46. The structural conservation in curli subunits may enable mixed fiber formation and thus allow multispecies contribution of curli monomers to the biofilm matrix. It is interesting to speculate that the solenoid polymorphisms found in the conformational curlin families defined in this work, i.e., CS, NCS and D, may result in some specificity of curlin cross-seeding and possibly in multispecies biofilm associations. In recent years, increasing attention has also gone to the potential cross-seeding activity of curli released by commensal and pathogenic Proteobacteria towards human pathological amyloids, with multiple reports indicating an in vitro and in vivo seeding or stimulatory activity towards α-synuclein amyloidogenity12,47,48. In this respect, it is interesting to note that our structural similarity of the human Alphafold protein structure database identifies several proteins with open-edged β-solenoid domains with high structural similarity to the curlin fold (Supplementary Table 2; Supplementary Fig. 15b), including extracellular and mucosal proteins like keratin associated proteins and mucins. This may warrant an increased attention to a potential interaction of mucosal matrix proteins and curli-producing commensals and pathogens in the intestinal and urinary tract./p>

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